La PCR quantitative, nouveautés à l’horizon

Le concept technologique de la réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction ou PCR), découvert par Kary Mullis en 1983 [1] et qui lui a valu le prix Nobel de chimie en 1993, est aujourd’hui devenu un outil quasiment universel dans le domaine de la biologie.

La PCR est une méthodologie hautement sensible et spécifique pour la détection des acides nucléiques. Son usage s’est considérablement étendu à de nombreuses applications, dont l’analyse quantitative d’acides nucléiques spécifiques (ADN et ADNc) dans un échantillon donné.

11

Les premières approches de quantification de gènes par PCR ou de transcrits géniques par rétrotranscription PCR (RT-PCR) ont reposé sur une analyse de titration faisant appel à l’utilisation d’une solution titrée d’acide nucléique (ou standard externe) servant à l’élaboration d’une gamme d’étalonnage obtenue par dilutions en série du standard externe [2]. Le résultat de l’analyse donne une évaluation de la quantité relative de matrice cible par rapport au standard. Cependant, la précision des résultats obtenus est très souvent limitée, du fait de la grande variabilité d’efficacité d’une PCR à l’autre. L’introduction d’un standard interne coamplifié au cours de la même réaction PCR a permis de corriger en partie la variabilité tube à tube et a conduit au développement de deux méthodologies différentes de quantification : celles par PCR différentielle et celles par PCR compétitive.

Dans les approches de quantification par PCR (ou RT-PCR) différentielle [3], une séquence endogène, c’est-à-dire appartenant à un gène dit de référence présent dans l’échantillon testé (séquence endogène d’un gène présent à l’état d’une seule copie par génome haploïde ou transcrit d’un gène domestique dont la transcription est constante et indépendante de l’environnement extracellulaire), sert de standard interne. La séquence endogène standard est coamplifiée avec la séquence cible au cours d’une même réaction PCR utilisant deux couples d’amorces spécifiques. La méthode permet d’évaluer la quantité relative de gène cible par rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la quantité et la qualité d’acide nucléique extrait. Néanmoins, la quantification à l’aide d’un gène endogène comme standard interne nécessite des conditions d’application extrêmement normalisées afin de s’assurer que l’amplification des deux séquences différentes (gène cible et gène de référence) s’effectue avec des efficacités identiques.